蛋白濃度測(cè)定的方法

　　蛋白濃度測(cè)定的方法：
 

　　1. 紫外分光光度法
 

　　紫外光譜吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量是講蛋白質(zhì)溶液直接在紫外分光光度計(jì)中測(cè)定的方法，不需要任何試劑，操作簡(jiǎn)單且易回收。蛋白質(zhì)溶液在280nm附近有強(qiáng)烈的吸收，這是由于蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸殘基而引起的，所以光密度受這兩種氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取過(guò)程中雜有的核酸對(duì)測(cè)定結(jié)果引起極大誤差，其最大吸收在260nm。所以同時(shí)測(cè)定280及260nm兩種波長(zhǎng)的吸光度，通過(guò)計(jì)算可得較為正確的蛋白質(zhì)含量。
 

　　2. 雙縮脲法
 

　　利用半飽和硫酸銨或27.8%硫酸鈉——亞硫酸鈉可使血清球蛋白沉淀下來(lái)，而此時(shí)血清白蛋白仍處于溶解狀態(tài)，因此可把兩者分開，這種利用不同濃度的中性鹽分離蛋白的方法稱為鹽方法。鹽析分離蛋白質(zhì)的方法不僅用于臨床醫(yī)學(xué)，而且還廣泛地用于生物化學(xué)研究工作中，如一些特殊蛋白質(zhì)—酶、蛋白激素等的分離和純化。
 

　　蛋白質(zhì)和雙縮脲一樣，在堿性溶液中能與銅離子形成紫色絡(luò)合物(雙縮脲反應(yīng))，且其呈色深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，因此可于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。
 

　　但必須注意，此反應(yīng)并非蛋白質(zhì)所*，凡分子內(nèi)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的肽鍵的化合物以及分子內(nèi)有—CH2—NH2等結(jié)構(gòu)化合物，雙縮脲反應(yīng)也呈陽(yáng)性。本實(shí)驗(yàn)用27.8%硫酸鈉—亞硫酸鈉溶液稀釋血清，取出一部分用雙縮脲反應(yīng)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，剩余部分則用濾紙過(guò)濾，使析出的球蛋白與白蛋白分離，取出濾液用同一反應(yīng)測(cè)定白蛋白的含量。總蛋白與白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白與球蛋白之比即所謂的白/球比值。
 

　　3. Folin-酚試劑法
 

　　目前實(shí)驗(yàn)室較多用Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，此法的特點(diǎn)是靈敏度高，較雙縮脲高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，較紫外法略高，操作稍微麻煩，反應(yīng)約在15分鐘有最大顯色，并最少可穩(wěn)定幾個(gè)小時(shí)，其不足之處是干擾因素較多，有較多種類的物質(zhì)都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。其原理是蛋白質(zhì)中含有酚基的酪氨酸，可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產(chǎn)生蘭色化合物，顏色深淺與蛋白含量成正比。
 

　　4. 考馬氏亮藍(lán)G-250
 

　　此方法是1976年Bradform建立。染料結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高，可檢測(cè)到微量蛋白，操作簡(jiǎn)便、快迅，試劑配制極簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，但干擾因素多。考馬氏亮藍(lán)G-250具有紅色和青色兩種色調(diào)、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色，當(dāng)它通過(guò)疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合后，變成藍(lán)色，最大吸收波長(zhǎng)從465nm轉(zhuǎn)移到595nm處，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與 595nm的吸光度成正比，測(cè)定595nm處光密度值的增加即可進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。
 

　　以上便是實(shí)驗(yàn)室中常見的幾種蛋白濃度測(cè)定的方法，另外還有凱氏定氮法和BCA法，有凱氏定氮法結(jié)果精確，但操作復(fù)雜，BCA法又以其試劑穩(wěn)定，抗干擾能力較強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度高而受到歡迎。