Mich單鏈DNA定量檢測試劑盒：高靈敏度熒光法原理與操作指南

　　一、技術原理
 

　　Mich單鏈DNA定量檢測試劑盒基于熒光染料與單鏈DNA(ssDNA)的特異性結合實現定量檢測。其核心原理如下：
 

　　熒光染料結合機制
 

　　試劑盒中的熒光染料(如SYBR Green I類似物)可嵌入單鏈DNA的堿基對間，形成穩定的染料-DNA復合物。當染料與單鏈DNA結合時，其熒光信號顯著增強(通常增強100-1000倍)，而游離染料的熒光極弱。通過檢測熒光強度，可間接反映單鏈DNA的濃度。
 

　　非特異性結合的局限性
 

　　需注意，該染料對雙鏈DNA(dsDNA)和RNA也可能產生弱結合信號，但試劑盒通過優化染料濃度和反應體系，優先檢測單鏈DNA。若樣本中存在大量雙鏈DNA或RNA，需通過預處理(如加熱變性)將其轉化為單鏈形式，或選擇特異性更高的探針法試劑盒。
 

　　標準曲線法定量
 

　　通過已知濃度的單鏈DNA標準品(如1-200 ng范圍)建立標準曲線，將待測樣本的熒光信號與標準曲線對比，計算樣本濃度。
 

　　二、操作指南
 

　　1. 實驗準備
 

　　試劑盒組分
 

　　濃縮檢測試劑(含熒光染料)
 

　　稀釋緩沖液
 

　　預稀釋的DNA標準品(1-200 ng范圍)
 

　　專用檢測管(推薦使用Mich Assay Tube，避免側壁標注干擾熒光信號)
 

　　儀器與耗材
 

　　熒光計或熒光酶標儀(需支持485 nm激發/520 nm發射波長)
 

　　移液器(覆蓋1-20 μL和100-200 μL量程)
 

　　DNase-free耗材(避免核酸酶污染)
 

　　樣本要求
 

　　樣本體積：1-20 μL
 

　　濃度范圍：50 pg/μL - 200 ng/μL(檢測范圍1-200 ng)
 

　　兼容性：可耐受鹽、游離核苷酸、溶劑、去污劑或蛋白等污染物，但需避免強酸強堿或高濃度變性劑(如尿素、甲酰胺)。
 

　　2. 實驗步驟
 

　　試劑與樣本準備
 

　　將試劑盒組分恢復至室溫(25℃)。
 

　　輕輕顛倒混勻檢測試劑，瞬時離心(避免渦旋振蕩產生氣泡)。
 

　　準備標準品：取10 μL標準品1(10 ng/μL)和標準品2(100 ng/μL)分別加入檢測管，補加190 μL稀釋緩沖液至終體積200 μL。
 

　　樣本檢測
 

　　取180-199 μL稀釋緩沖液加入樣本檢測管，加入1-20 μL待測樣本(終體積200 μL)。
 

　　輕輕渦旋振蕩3-5秒，避免產生氣泡。
 

　　室溫避光孵育2分鐘，使染料與單鏈DNA充分結合。
 

　　熒光信號讀取
 

　　將檢測管放入熒光計，選擇“ssDNA High Sensitivity”檢測程序。
 

　　記錄熒光信號值，根據標準曲線計算樣本濃度。
 

　　3. 注意事項
 

　　熒光淬滅控制
 

　　染料易受光降解，實驗全程需避光操作(如使用鋁箔包裹檢測管)。
 

　　檢測工作液配制后需在3小時內完成檢測，避免熒光信號衰減。
 

　　標準品與樣本處理
 

　　標準品需上下顛倒混勻后瞬時離心，避免沉淀影響濃度準確性。
 

　　樣本若含高濃度鹽或去污劑，建議用稀釋緩沖液進行1:10預稀釋。
 

　　污染防控
 

　　使用DNase-free耗材，避免核酸酶降解樣本。
 

　　實驗區域需分區操作(如配液區、樣本處理區、檢測區)，防止交叉污染。
 

　　三、技術優勢
 

　　高靈敏度
 

　　可檢測低至50 pg/μL的單鏈DNA，適用于痕量樣本(如循環腫瘤DNA、病毒基因組)的定量分析。
 

　　寬檢測范圍
 

　　線性檢測范圍達1-200 ng，覆蓋大多數實驗需求(如NGS文庫構建、qPCR模板定量)。
 

　　操作簡便
 

　　無需復雜純化步驟，直接混合樣本與檢測工作液即可讀數，單次檢測耗時<5分鐘。
 

　　污染物耐受性強
 

　　對鹽、蛋白、去污劑等常見污染物耐受閾值高，減少樣本預處理步驟。
 

　　四、Mich單鏈DNA定量檢測試劑盒應用場景
 

　　基因編輯與合成生物學
 

　　定量評估CRISPR-Cas9編輯后單鏈DNA修復模板的濃度。
 

　　液態活檢
 

　　檢測血漿中循環游離DNA(cfDNA)的單鏈片段比例，輔助腫瘤早期診斷。
 

　　NGS文庫構建
 

　　優化文庫投入量，確保Illumina等平臺建庫成功率。
 

　　病毒學研究
 

　　定量分析病毒基因組單鏈RNA(如HIV、HCV)逆轉錄后的單鏈DNA中間體。